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O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do laser de baixa potência de 780nm em diferentes períodos de 7,14, 21 dias após criolesão, incluindo a dose (10 ou 50J/cm2), para promover um melhor reparo muscular evidenciado por  analise histopalogica e imunihistoquimica. 54 ratos do sexo masculino foram divididos em três grupos:  grupo lesão controle (CG) – animais lesionados sem tratamento; grupo lesionado tratado 780nm, 10J/cm2 (G10); e grupo lesionado tratado 780nm, 50J/cm2 (G50). Cada grupo foi dividido em três subgrupos (n=6): 7, 14 e 21 dias pós lesão.

Resultados histopatológicos revelaram uma melhor organização de fibras musculares  no G10 e G50 durante os períodos de 7 e 14 dias comparados com o CG.

O G10 e G50 durante 7 dias demonstraram redução significante da área da lesão comparado com o CG, sem diferenças entre os grupos tratados por 14 e 21 dias. 

O G10 mostrou um aumento na quantidade de vasos após 14 dias comparados com o G50, mas não em relação ao controle. No que diz respeito a analise imunihistoquimica  do fator MyoD, o G10 e G50 durante 7 dias mostraram maior concentração de immunomarkers do que o grupo controle. Myogenin immunomarkers fora similares aos observados nos dias 7 e 14 em todos os 3 grupos analisados,  enquanto que immunomarkers não foram encontrados em nenhum dos grupos após 21 dias de laserterapia.

Os resultados mostraram que o laser, independente da dose aplicada, possuem efeitos positivos no reparo muscular.

Introdução:
Lesão muscular é um trauma comum que pode causar dor e incapacidade, levando a uma deficiência  tanto para atividade ocupacional quanto de lazer. Varios mecanismos podem estar envolvido na lesão muscular: trauma direto (tensão, contusão ou laceração) e trauma indireto (isquemia e disfunções neurológicas), que são os mais comuns.

Isquemia (do grego ισχαιμία; isch- restrição, hema sangue) é a falta de suprimento sanguíneo para um tecido orgânico devido a obstrução causada por um trombo, seja ele formado por placas gordurosas ou por coágulos sanguíneos. Como osangue, através das hemácias (glóbulos vermelhos), leva o oxigênio às células, a isquemia resulta em falta de glicose e de oxigenação nas células (hipóxia).¹ O local mal oxigenado tende a ficar roxo e se não for tratado com urgência pode causar a morte.

Dilacerar: Rasgar em pedaços; despedaçar com violência:

Estudos tem demonstrado que o laser de baixa potência ajuda na reparação muscular e animais experimentais por agir positivamente na quantidade de fibras musculares, agiogenesis e formação de myotubos, assim acelerado o processo de reparo muscular.  Esses fatores são desejados na clinica prática para o tratamento de injúrias musculares extensas ou em populações com debilidade de reparo muscular. (idosos)

Entretanto, o mecanismo por qual ocorre a ação do laser na aceleração do reparo muscular não é ainda bem entendido. Portanto , é importante estudar o efeito da laserterapia em parâmetros histológicos e imunohistoquimico, assim permitindo o impacto terapêutico na agiogenese e fatores regulatório myogenicos (myogenic regulatory factors e.G MyoD and myogenin) para ser avaliado.

Adicionalmente, é possível observar que ainda não há consenso na literatura que considerem os melhores parâmetros para serem usados na terapia do laser de baixa potência.

Cressoni et al. Avalio o efeito do AlGalnP laser (785 nm) na regeneração muscular, reportando que durante a fase aguda, há uma diminuição da fase inflamatória, redução da quantidade de leucócitos na área lesionada e aceleração do reparo de tecido conjuntivo.

Rizzi et al. Observaram o efeito da aplicação do GaAIAs laser por 20J/cm2 no músculo masseter, reportando um aumento no metabolismo das fibras musulares.

Rizzi EC, Issa JPM, Dias FJ, Leão JC, Regalo SCH, Siéssere S,

Watanabe I, Iyomasa MM (2010) Low-level laser intensity application in masseter muscle for treatment purposes. Photomed

Laser Surg 28:31–35

Weis e Oron avaliaram o efeito  do HeNe laser (632.8 nm) na regeneração muscular de ratos, e encontraram no grupo irradiado uma recuperação mais rápida comparado com o grupo apenas lesionado  (não tratado).

Portanto, ainda estudos ainda são necessários para determinar os melhore parâmetros para a regeneração muscular, o que ira permiti a terapia com laser  de ser seguramente aplicada durante a prática clínica.

O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar o efeito do laser de baixa potência com comprimento de onda de λ=780 nm  em músculos em reparo após criolesão durante diferentes períodos de tratamento (7, 14 e 21 dias) por meios de analise histopatológica e immunihostoquimica.

Histopatologia: Histopatologia ou Histologia patológica é o estudo de como uma doençaespecífica afeta um conjunto de células (tecido). Geralmente é feito um estudo da biópsia (amostra de células coletadas da área infectada) usando um microscópio e corantes. Também pode ser feito durante uma cirurgia ou em uma autópsia (investigação da morte). Esse estudo pode ser feita em células de um animal, vegetal ou até mesmo de fungos. Para conservar as células geralmente elas são colocadas em uma solução de água com 10% de formol. Quando se trata de células humanas, o médico especialista que normalmente faz esse exame é o patologista. No caso de animais é pode ser feito por veterinários, biólogos ou outro profissional especialistas nessa área.

Imuno-histoquímica ou IHQ se refere ao processo de localizar antígenos (e.g. proteínas) em células de uma amostra de tecido, explorando o princípio da ligação específica de anticorpos a antígenos no tecido biológico.¹ O nome da técnica provém das raízes "imuno", em referência aos anticorpos utilizados no procedimento, e "histo", significando tecido (compare com imunocitoquímica). A coloração imuno-histoquímica é amplamente utilizada no diagnóstico de células anormais, tais como aquelas encontradas em neoplasias. Marcadores moleculares específicos são característicos de eventos celulares particulares, tais como proliferação ou morte celular (apoptose). IHQ é também amplamente utilizada na pesquisa básica para compreender a distribuição e localização de biomarcadores e proteínas diferentemente expressas em diferentes partes de um tecido biológico. A visualização de uma interação antígeno-anticorpo pode ser obtida de diversas formas. Na situação mais comum, um anticorpo é conjugado a uma enzima, como uma peroxidase, que pode catalisar uma reação que produzirá coloração. Alternativamente, o anticorpo pode também ser marcado com um fluoróforo, comofluoresceína, rodamina, Flúor DyLight ou Flúor Alexa 

Methods

Animals

Fifty-fourWistar male rats (weighing 300±20 g) were used in

the current study. They were maintained under controlled

temperature (22+2 °C), light–dark periods of 12 h and with

free access to water and commercial diet. All animal handling

and surgical procedures were strictly conducted according to

the Guiding Principles for the Care and Use of Laboratory

Animals. This study was approved by the Ethics Committee

of the Federal University of São Carlos (068/2009).

Animals were randomly distributed into three groups:

injured control group (CG)—injured animals without any

treatment; injured 780-nm laser-treated group, at 10 J/cm2

(G10); and injured 780-nm laser-treated group, at 50 J/cm2

(G50). Each group was divided into three different subgroups

(n=6), and on days 7, 14 and 21 post-injury, rats

were sacrificed. Treatments started 48 h post-surgery and

were performed every 24 h during 5, 10 and 15 sessions.

Experimental design

Surgery

Animals were anaesthetised with ketamine (Dopalen,

40 mg/kg, IP; Vetbrands, São Paulo, Brazil) and xylazine

(Anasedan, 20 mg/kg, IP; Vetbrands, São Paulo, Brazil) and

exposed to cryolesion of the right tibialis anterior (TA) muscle.

The cryolesion consisted of two freeze–thaw cycles of the

muscle in situ. Freezing involved applying the flat end (0.5 by

0.5 cm) of a piece of iron, precooled in liquid nitrogen, was

then kept for 10 seconds on the center of the muscle. The

procedure was repeated twice consecutively, with a time interval

of 30 seconds. Finally, the skin was sutured. The cryolesion

procedure causes injury in the satellite cells, basal

lamina, blood vessels and nerve fibres, inducing a rapid and

extended necrosis of myofibrils, followed by a relatively slow

regeneration process [5, 9–11].

LLLT protocol

A low-energy GaAlAs laser (MM Optics, São Carlos equipment,

São Paulo, Brazil), with a 780-nm continuous wavelength,

a 4.0-mm2 beam diameter, a dose of 10 J/cm2 (20mW)

and 50 J/cm2 (40 mW) and an irradiation time of 20 and 50 s

(total energy per point 0.4 and 2 J), respectively, was used in

this study. The irradiation was performed daily, at one point,

above the area of the injury, through the punctual contact

technique. On 7, 14 and 21 post-injury days, animals were

sacrificed (with profound sedation and overdose of ketamine

and xilazine (0.5 mL each)) in order to extract their TA

muscles. These time points post-injury were selected in order

to evaluate the effect of laser on the different phases of muscle

regeneration: the inflammatory phase, until 7 days; the repair

phase, between 7 and 14 days; and finally the phase of

remodelling, between 14 and 21 days [12].

Histopathological analysis

Muscles obtained from all experimental and control groups

were washed immediately with saline, and for each specimen,

a fixation was carried out in 10 % buffered formalin

(Merck, Darmstadt, Germany) for 24 h, followed by dehydration

in a graded series of ethanol and embedding in

paraffin. Cross-section (5 μm) of TA muscle were prepared

using a microtome (Leica Microsystems SP 1600, Nussloch,

Germany). Five sections of each specimen were stained with

hematoxylin and eosin (HE stain, Merck). Histopathological

evaluation was performed by an experienced pathologist

(DAR) (blinded to the treatment) and carried out under a

light microsce Olympus, Optical CO, Ltd, Tokyo, Japan),

at×20 magnification. The qualitative analysis considered

any changes at the injury site, such as presence of

inflammatory process, granulation tissue, necrosis area,

focal or diffuse myofibrillary degeneration and/or tissue

structure [11].

Morphometry of the injured area

For morphometric evaluation, one histological cross section

of each TA muscle located in the central region of muscle

injury was chosen to measure the cross-sectional area of

both injured and uninjured muscle, using a software for morphometry (Axiovision 3.0.6 SP4, Carl Zeiss, Jena,

Germany). Images were used to reconstruct the total muscle

cross-sectional area, allowing the identification and measurement

of both injured and uninjured areas. A doubleblind

procedure was used for both muscle cross-sectional

image selection and injured and uninjured muscle area

measurements.

Number of blood vessels

To determine the number of blood vessels at the area of injury,

five pictures from different regions at the injured area were

obtained by a light microscope (Olympus, Optical Co., Ltd.,

Tokyo, Japan), at a magnification of×40. The number of

blood vessels was counted in each field by the morphometric

software (Axiovision 3.0.6 SP4, Carl Zeiss, Jena, Germany).

Immunohistochemistry

Muscle cross sections of 4 μm were deparaffinised in xylene

and rehydrated in graded ethanol, then pretreated by microwave

(Brastemp, São Paulo, Brazil) with 10 mM citric acid

buffer (pH=6) for 3 cycles of 5 min each at 850Wfor antigen

retrieval. Thematerialwas pre-incubated with 0.3%hydrogen

peroxide in phosphate-buffered saline (PBS) for 5 min for

inactivation of endogenous peroxidase and then blocked with

5 % normal goat serum in PBS solution for 10 min. The

specimens were then incubated with anti-MyoD and antimiogenina

antibodies (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a

concentration of 1:400. Incubation was carried out overnight

at 4 °C within a refrigerator and followed by two washes in

PBS for 10 min. The sections were then incubated with biotinconjugated

secondary antibody (anti-rabbit IgG) (Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA) at a concentration of

1:200 in PBS for 1 h. The sections were washed twice with

PBS before the application of preformed avidin–biotin complex

conjugated to peroxidase (Vector Laboratories,

Burlingame, CA, USA) for 45 min. The bound complexes

were visualised by the application of a 0.05%solution of 3,3′-

diaminobenzidine and counterstained with Harris hematoxylin.

For control studies of antibodies, the serial sections were

treated with rabbit IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA,

USA) at a concentration of 1:200 in place of the primary

antibody. Additionally, internal positive controls were performed

with each staining bath.

Immunohistochemical data were evaluated by an experienced

pathologist (DAR) under subjectivemorphologic analysis

as established in previous studies conducted by our group [11].

Statistical analysis

The results are given as means and standard deviations. Data

from morphometry of the injured area and number of blood

vessels analysis were evaluated using two-way ANOVA,

followed by the post hoc Student–Newman–Keuls method.

Level of statistical significance was defined as p<0 .05.="" o:p="">

Statistical evaluation was carried out using STATISTICA 7.